Colorazione istologica con Dapi: caratteristiche e procedimento

Il 4’,6-Diamidino-2-fenillindolo cloridrato (DAPI) è un colorante organico fluorescente che lega fortemente regioni del DNA ricche in sequenze A-T. Esso è largamente utilizzato nella microscopia a fluorescenza.

In particolare, viene impiegato per la colorazione del DNA, dei nuclei, di cellule vive e fisse, per la controcolorazione in colorazioni in immunofluorescenza di materiale umano e botanico, e in flussocitometria.

Procedimento

La colorazione inizia con due passaggi: la "sparaffinatura", di modo da pulire i tessuti in questione dalla paraffina, e l’idratazione attraverso l’utilizzo di una scala decrescente di etanoli, poiché i coloranti sono utilizzati in soluzione acquosa.

In particolare:

1. Sparaffinatura:

• Xilene 1 per 10 minuti;
• Xilene 2per 10 minuti.

2. Idratazione:

• EtOH 100 %   passaggio rapido;
• EtOH  95 %  per 2 minuti;
• EtOH 75 %   per 2 minuti;
• EtOH 50 %   per 2 minuti;
• H₂0 distillata passaggio rapido.

A questo punto, si procede con la colorazione istologica. Specificamente:

• lavaggio in PBS 1x  per 10 minuti;
• lavaggio in PBS 1x tween 20  per 10 minuti;
• adagiare i vetrini nella camera umida e considerare 1,5 mL di PBS 1x tween 20 + 1 µl di dapi. Quindi, porre il quantitativo desiderato della soluzione sulle sezioni di tessuto x 15 min (avere cura di riparare il tutto, di modo da proteggere il dapi dalla luce);
• lavaggio in PBS 1 x tween 20 per 10 minuti (avendo cura di coprire la vaschetta utilizzata per la colorazione istologica con la carta argentata, di modo da proteggere il dapi dalla luce);
• fare due lavaggi in PBS 1x per 5 minuti (avendo cura di coprire la vaschetta utilizzata per la colorazione istologica con la carta argentata, di modo da proteggere il dapi dalla luce).

Alla fine, segue la chiusura dei vetrini istologici:

• applicare il montante alle sezioni di tessuto, quindi adagiarvi sopra i vetrini copri oggetti (per fissarli bene al vetrino porre dello smalto alle estremità).

A questo punto, buona visione scienziati!

                             Giovanna Spinosa

Fonti

• Morikawa, Kosuke, and Mitsushiro Yanagida. "Visualization of individual DNA molecules in solution by light microscopy: DAPI staining method." The Journal of Biochemistry 89.2 (1981): 693-696;
• Otto, Friedrich. "DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA." Methods in cell biology. Vol. 33. Academic Press, 1990. 105-110.