Biologia forense pt. 2: analisi delle tracce biologiche

L'analisi delle tracce biologiche avviene su campioni di DNA estratti dalle stesse prove rinvenute in una scena del crimine. Affinché questo tipo di studio possa portare risultati attendibili è necessario che il suddetto campione di DNA sia estratto correttamente, evitando contaminazioni.

In particolare, la contaminazione del campione originale può avvenire mediante l'aggiunta di DNA esogeno durante la raccolta dei campioni biologici e le fasi analitiche di estrazione e amplificazione dello stesso acido nucleico.

Per tale motivo, alla fine di un processo di estrazione e amplificazione è sempre necessario verificare la presenza di possibili contaminazioni, mediante l'analisi di più campioni di controllo.

Difatti, l'estrazione del DNA dal materiale biologico è una fase estremamente delicata perché se il campione viene contaminato, non si possono più scindere i profili genetici in esso presenti.

Per evitare che ciò avvenga è necessario tenere separati bene i campioni l'uno dall'altro, conservandoli disgiunti. Inoltre, per evitare che sia l'operatore a commettere errori occorre adottare degli accorgimenti particolari, quali: camice, guanti, mascherina e cuffia per capelli.

L'estrazione viene effettuata con diverse tecniche.

Estrazione organica

L'estrazione organica utilizza un buffer Tris - HCl a pH 8 al quale si aggiungono SDS (detergente anionico che altera la struttura secondaria delle proteine, favorendo la lisi delle membrane cellulari) e proteinasi K, che agiscono come endopeptidasi (oltre a favorire la lisi cellulare, eliminano le DNAasi).

Una volta eseguiti i trattamenti enzimatici, si aggiunge al campione: soluzione di fenolo, cloroformio e alcol isoamilico, poi si centrifuga 3000 rpm a 4 °C per 5 minuti (di modo da separare gli acidi nucleici d'interesse dalle altre componenti cellulari).

A questo punto, nelle provette otteniamo una fase acquosa contenente il DNA polare, una fase intermedia con le proteine denaturate e una fase fenolica contenente lipidi e proteine ricche di amminoacidi negativi. Il DNA nella fase acquosa viene separato per precipitazione alcolica a freddo, in presenza di cationi monovalenti.

Estrazione con resina

In questa tipologia di estrazione, si può usare una resina a scambio cationico (detta, chelex), che va a chelare i gruppi funzionali legando a sé gli ioni metallici polivalenti, come il magnesio. Il prodotto di questa reazione è un DNA a singolo filamento, poiché la chelex va a denaturare la doppia elica.

Estrazione differenziale

Questa tecnica viene impiegata nei casi di vittime di abusi sessuali, e permette di separare la componente epiteliale della vittima da quella spermatica dell'aggressore.

Ciò è possibile in quanto l'estrazione differenziale consente la lisi delle cellule epiteliali della vittima, che vengono separate dalla fase rimanente contenente gli spermatozoi dell'aggressore.

Da un punto di vista esecutivo, si effettua incubazione con DTT, composto in grado di idrolizzare i ponti disolfuro tipici della parete degli spermatozoi.

Infine, esistono metodi di estrazione basati sull'uso di microsfere magnetiche che, sfruttando la carica negativa del DNA, lo separano dalle altre componenti cellulari.

Analisi del DNA

L'analisi del DNA è una tecnica necessaria perché i campioni di DNA prelevati dalla scena del crimine sono spesso esigui, dunque vanno amplificati. Tale analisi si basa sul principio per cui non esistono due individui (tranne gemelli omozigoti) che abbiano genomi con la stessa sequenza amminoacidica.

La risoluzione si è avuta grazie alla scoperta dei polimorfismi genetici, cioè le forme variabili di un allele nella popolazione. In particolare, la meno frequente delle forme polimorfiche è presente con frequenza maggiore o uguale all'1%, se è meno dell'1% non è una variante polimorfica, ma una variante rara.

Qui di seguito, sono riportati esempi di polimorfismi genetici utilizzabili a scopo identificativo:

• sequenze ripetute intersperse ipervariabili, ovvero sequenze che si ripetono in posizioni diverse nei genomi di individui differenti;
• STR (short tandem repeats) o sequenze microsatelliti, brevi ripetizioni in tandem di una sequenza lunga 2 - 10 bp.

Fingerprinting

Il primo metodo per analizzare il DNA su scene del crimine è attraverso la determinazione delle impronte genetiche di un individuo, mediante l'analisi delle sequenze ripetute intersperse ipervariabili.

Il campione di DNA viene digerito con specifiche endonucleasi di restrizione e i frammenti che ne derivano vengono separati tramite elettroforesi su gel d'agarosio. A questo punto, i frammenti separati sono trasferiti su membrana mediante southern blot.

Successivamente, i frammenti vengono incubati con una sonda marcata contenente la sequenza ripetuta. Dunque, sarà possibile apprezzare la formazione di tante bande, ognuna corrispondente ad un frammento di restrizione della sequenza ripetuta.

Dato che le posizioni sono variabili, eseguendo la stessa procedura con campioni di DNA di soggetti diversi, il profilo delle bande sarà differente. Esiste tuttavia una possibilità, anche se molto bassa, che due individui presentino la stessa impronta genetica, o un'impronta molto simile.

PCR di STR

L'FBI ha progettato un pannello di tredici loci STR utilizzabile come standard per le investigazioni in nord America. Questi 13 loci costituiscono il CODIS, utilizzato per la tipizzazione dei loci STR stessi, al fine di identificare gli individui della popolazione americana.

Mentre, l'ENFSI e l'EDNAP hanno selezionato 17 loci STR che costituiscono lo standard set europeo, ed è abbastanza sovrapponibile al CODIS.

DNA profiling

L'analisi mediante PCR di sequenze polimorfiche (STR) ha come scopo quello di ottenere un'elettroferogramma rappresentativo del profilo di DNA.

L'elettroferogramma rappresenta una serie di picchi elettroforetici corrispondenti ai genotipi che caratterizzano ogni locus STR identificato. Il più importante STR del genoma umano è la sequenza ripetuta CAN, dove N rappresenta il numero di unità ripetitive compreso tra 5 e 20. Tale numero di unità ripetitive è variabile nei vari individui.

Quando si deve determinare il profilo di DNA di un individuo, il ricercatore deve disporre di informazioni dettagliate sulla frequenza dei polimorfismi STR. A tal proposito, sono state create banche dati sulla frequenza degli alleli STR nelle varie popolazioni, in modo da poter essere utilizzate come riferimento nella rilevazione del profilo di DNA.

Quindi, si tipizzano gli alleli di ciascun locus STR considerato eseguendo una PCR con primer marcati con gruppi fluorescenti in grado di appaiarsi a tratti di DNA fiancheggianti le STR, si va ad effettuare l'amplificazione e costruire l'elettroferogramma.

I frammenti amplificati vengono identificati mediante elettroforesi capillare su gel, su cui assumeranno posizioni differenti dipendenti dalla loro dimensione. Quindi, in base alle dimensioni degli alleli stessi, si potranno osservare le posizioni delle bande per identificare gli alleli presenti nel campione analizzato.

Le dimensioni dei frammenti di ciascuna banda si misurano con l'impiego di laser e fotocellule (rilevatori di fluorescenza). Inoltre, facendo una PCR multiplex è possibile amplificare insieme due STR.

Quindi, in questo modo, attraverso la scienza, è possibile identificare il colpevole ed ottenere giustizia!

                                                                                                        Giovanna Spinosa

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Fonti

• http://www.revistasbolivianas.ciencia.bo/scielo.php?pid=S1813-53632010000200011&script=sci_arttext&tlng=es;
• https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-88-470-1512-8_9;
• https://link.springer.com/article/10.1007/s00414-005-0545-9.